Unidad de Citometría de flujo y masas

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Dra. Concepción Marañón

Responsable Científica

La Unidad de Citometría de flujo y masas de Genyo se dedica a la aplicación y el desarrollo de diferentes técnicas enfocadas a detección de las características de las partículas biológicas a través de la citometría de flujo, masas y la separación celular, con el fin de facilitar los máximos avances en la investigación biomédica.

La citometría es la tecnología que permite medir propiedades físicas y químicas de células vivas u otras partículas biológicas. En este área nos encontramos con la citometría de flujo y su nueva variante, la citometría de masas.

El fundamento de la CITOMETRÍA DE FLUJO se basa en hacer pasar una suspensión de partículas alineadas y delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estas señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales, que son procesadas por un equipo informático.

La citometría tiene su base junto con los primeros avances en microscopía. Se comenzó investigando la incidencia de la luz (UV) sobre las muestras, pero no fue hasta 1934 cuando se desarrolló la primera técnica de conteo de células en un capilar, en 1880s se empezó a utilizar fluorocromos y en los años 1960-70s se incorporaron a la citometría para medir el contenido de ADN de las células y realizar inmunofenotipaje. Con el tiempo, se empezó a pensar en la separación celular asociada a la citometría. En Estados Unidos (Los Alamos National Laboratories), se desarrolló el primer contador celular capaz de medir las células y cargarlas en gotas y separarlas. Los separadores celulares tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo, pero con la capacidad adicional de separar y recuperar partículas selectivamente de la suspensión líquida en función de sus características.

La citometría de flujo ha sido y es fundamental en la ciencia, los beneficios que se ha obtenido y que se siguen obteniendo con esta tecnología son innumerables, pero tiene su limitaciones, principalmente cuando queremos medir más de 10 parámetros tenemos el gran problema de la superposición de los espectros de emisión, y el ruido de fondo.

Estas limitaciones llevaron a la búsqueda de nuevas soluciones capaces de medir de forma simultánea en una única célula multitud de parámetros. De esta forma apareció la CITOMETRÍA DE MASAS, donde se combinan dos grandes tecnologías bien establecidas como son la citometría de flujo  y la espectrometría de masas.

Este método ofrece la posibilidad de analizar de forma simultánea más de 35 parámetros sin problemas de superposición entre espectros y disminuyendo el ruido de fondo. El Dr. Sean C. Bendall y sus colaboradores fueron los pioneros, ellos en vez de usar moléculas fluorescentes usaron isotipos estables de elementos químicos pesados (metales de transición y lantánidos) para marcar los anticuerpos. Hay un total de aproximadamente 50 elementos disponibles.

Como la principal diferencia entre cada uno de estos elementos es su masa atómica, los podemos discriminar en base a su peso. El único equipo que puede hacer este trabajo es el espectrómetro de masas con un analizador de tiempo de vuelo (TOF-MS).

El fundamento de la técnica es el siguiente  las células son marcadas en suspensión con un panel diseñado de metales pesados conjugados con anticuerpos frente a dianas en la superficie y en el interior de las células, la técnica es muy similar a la citometría de flujo convencional. La alta pureza de los isotopos metálicos asegura un nivel muy bajo de background por solapamiento entre señales o por componentes celulares endógenos. En el interior de Helios las células son atomizadas individualmente para quedarnos solo con los iones metálicos. Los iones procedentes de cada célula marcada forman nubes aisladas de iones. Los metales iónicos son medidos en la cámara Time-Of-Flight (TOF) y en función de su carga y masa (m/z) tendrán diferentes tiempos de vuelo antes de llegar al detector, los cuales serán únicos y específicos. Finalmente, el detector produce un espectro de masas donde identifica y representa la cantidad de cada isotipo metálico marcado por célula. Los datos se obtienen en formato .fcs y se pueden analizar en software de análisis convencionales o específicos para muestras multiparamétricas.

Misión

La Unidad de Citometría de flujo y masas tiene como labor principal proporcionar apoyo técnico en el área de la citometría, tanto a los grupos de investigación del centro, como a entidades externas.

Gracias al equipamiento tecnológico de última generación que posee la unidad, y a la gran experiencia del personal responsable científico y técnico, es posible desarrollar las aplicaciones requeridas por los usuarios. De esta forma podemos alcanzar una de las prioridades de GENYO, como es la integración de la investigación básica, aplicada y traslacional, minimizando la transición entre el desarrollo de nuevas tecnologías, productos y procedimientos, y su aplicación en el ámbito sanitario. Igualmente, el equipamiento de la unidad pretende facilitar la generación de nuevos sistemas de diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades asociadas a la variabilidad genética humana mediante la aplicación de las nuevas tecnologías, con el fin de lograr una investigación de excelencia en el área de oncología y genómica aplicada a la salud.

01Asesoramiento a los usuarios del servicio de citometría de flujo.
    • Iniciación y entrenamiento de los distintos usuarios que hacen uso por primera vez de los citómetros analizado.
    • Supervisión de las operaciones diarias en los citómetros de flujo analizadores.
    • Asistencia a los usuarios en los problemas con los equipos.
    • Asistencia sobre metodología y diseño experimental.
02Aplicaciones.
    • Análisis multiparamétrico complejo: Mediante la combinación de fluorocromos compatibles con las líneas de láser y filtros o utilización de metales pesados, es posible realizar un inmunofenotipaje. El inmunofenotipaje se refiere a la utilización de herramientas inmunológicas, como anticuerpos acoplados a marcadores para la detección específica de antígenos localizados tanto en el interior como en la superficie de la célula. Permite identificar, enumerar y caracterizar cualquier célula individual o subcomponente celular. Con aplicaciones tan importantes como la identificación de enfermedades hematológicas, desordenes hematológicos, trasplantes, diagnóstico de enfermedades infecciosas, detección de la hemorragia fetomaterna, test de alergia basados en la en la activación de basófilos, activación plaquetaria, diagnóstico y monitorización de enfermedades autoinmunes, identificación y cuantificación de autoanticuerpos, identificación de fenotipos multiresistentes a las drogas en cáncer, cuantificación proteínas solubles, etc.
    • Detección de genes reporteros: Una de las técnicas más importantes para el estudio de expresión de un gen de interés es la fusión de genes reporteros o informadores, que permiten una determinación rápida y fácil de la actividad de un promotor. En citometría se utiliza mucho GFP como gen reportero.
    • Estudio de procesos de muerte celular: Puede diferenciarse si la célula está en una fase temprana o tardía de la apoptosis, o si por el contrario la muerte ha ocurrido por necrosis. Para ello se cuantifica la cantidad de Annexina-V unida a la fofatidilserina de la superficie de las células apoptóticas, o la internalización de Ioduro de Propidio (IP) o 7-aminoactinomycin (7-AAD), debido a la formación de poros en la membrana celular, típicos de las células necróticas.
    • Ciclo Celular y proliferación celular: En los estudios del ciclo celular pueden diferenciarse las distintas fases de división de una célula, en función de la cantidad de ADN, lo que nos permite calcular índices o ratios entre picos. Las fases que se diferencian en citometría son G0/G1, que corresponde a fase quiescente y de preparación para división con una cantidad de ADN 2n. Fase S, es la parte del ciclo con síntesis de ADN, por lo tanto el marcaje aumenta. Y la fase G2/M, donde aumenta la proporción de ADN el doble (4n). Los marcajes utilizados suelen ser IP, AmCyan, 7-AAD y BrdU, para citometría de flujo y IdU, pRB (Ser807/811), Cyclin B1, Ki67; pHistone H3 (Ser28), para citometría de masas.
    • Ensayos funcionales. Mediante citometría pueden cuantificarse aquellas propiedades dinámicas de las células que pueden modificarse rápidamente gracias a sensores fluorescentes, cuyas propiedades ópticas o de distribución cambian en respuesta al fenómeno de interés. Algunos ejemplos son detección de ROS, o la medida ratiométrica de Fluo/Indo para estudiar el flujo de calcio.
03Separación celular.
    • Las separaciones de células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés.

Para apoyar a la comunidad científica y desarrollar el tipo de estudios expuesto anteriormente, la Unidad de Citometría cuenta con el siguiente equipamiento:

Citómetro de masas CyTOF®2 upgrade to Helios

Fabricante: DVS Sciences (Fluidigm)
Características técnicas:
El sistema se basa en la tecnología de espectrometría de masas de Time-Of-Flight con plasma acoplado inductivamente (ICP-TOF-MS), este nos permite analizar muestras unidas a isotopos de metales pesados. Presenta un sistema de introducción automática de las muestras que aumenta la eficiencia en un 60% con respecto a versiones anteriores y podemos recolectar más datos en menos tiempo y con menos muestra. Además, permite adquirir hasta 5 ml de muestra lo que permite trabajar más fácilmente con barcoding, permitiendo adquirir todo el experimento sin necesidad de ir introduciendo muestras secuencialmente. El sistema de agitación elimina el problema de sedimentación. Se elimina el uso de jeringas para introducir la muestra y de solución transportadora, que hace diluir la muestra, es su caso se utiliza el argón. Tiene un nuevo inyector de muestra transformado que hace que la nube de iones procedentes de cada células sea la mitad de grande (aprox. 1mm) que las de CyTOF 1 y 2. Además, un amplificador de señal modificado que conserva el rango dinámico necesario por la señal necesitando menos señales por pulso, en definitiva, menos pulsos para detectar la señal, por lo que detecta más señales con menos ruido de fondo. Debido a estos dos cambios se dobla el número de células que pueden resolverse por unidad de tiempo. Helios escribe cuatro nuevos parámetros Gaussianos para discriminación en las fcs files: anchura, residual, centro y offset. Estos parámetros están pensados para diferenciar eventos de iones fusionados de los simples.

En general las características principales son:

    • Canales: 121 a 135
    • Rango de masas: 75–209 amu
    • Sensibilidad: 0.3% para 159Tb
    • Respuesta del instrumento: 400K a 600 K counts/pg 159Tb
    • Límite de detección: 350 anticuerpos/célula
    • Calibración: automática
    • Pico de rendimiento: 2.000 (eventos/seg)

Citómetro de flujo BD FACSCanto II™

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: Dispone de un láser azul Coherent® Sapphire™ de estado sólido refrigerado por aire (488 nm y 20 mW de potencia), que permite detectar cuatro colores. Un laser rojo JDS Uniphase™ HeNe (633 nm y 17 mW), para dos colores. El número total de detectores es de 8 (6 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). El software para adquirir muestras y analizar es FACSDiva. El sistema posee un módulo de calidad que permite optimizar voltajes y realizar un control y seguimiento del funcionamiento del sistema.

Citómetro de flujo BD FACSVerse™

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: BD FACSVerse™ es un citómetro de uso en investigación, dispone de tres líneas láser, 488 nm (azul) para 4 colores; 633 nm (rojo) para dos colores y violeta (407 nm) para dos colores. Puede detectar hasta 10 parámetros de dispersión (8 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). Presenta un sistema de laser que minimiza las pérdidas de luz y maximiza la resolución para aplicaciones multiparamétricas. Los láseres se caracterizan por presentar un micromotor para alineamiento automático. BD FACSVerse™, además de presentar las velocidades de adquisición estándar (alta, media y baja), presenta un modo de alta sensibilidad que hace más sencillo detectar partículas con marcaje débil. Su sistema fluídico permite adquirir muestras de forma manual en cualquier formato de tubo. Posee un cargador de muestras que permite analizar desde 30 a 40 tubos en una sola tanda, hasta placas de 96 y 384 pocillos. Dispone de medidor volumétrico. El software para adquirir muestras y analizar es FACSSuite. El sistema posee un módulo de calidad que optimiza voltajes y realiza un control y seguimiento del funcionamiento del equipo, lo que proporciona una gran reproducibilidad de los experimentos.

Separador celular BD FACSAria™

Fabricante: BD Bioscencies
Características técnicas: Dispone de tres líneas láser: El diodo Coherent® Sapphire™ de estado sólido azul (488 nm y 13 mW de potencia), permite detectar cinco colores; láser rojo (633 nm y 11 mW JDS Uniphase™ HeNe refrigerado por aire), para dos colores y el laser violeta en estado sólido (407 nm y 10 mW) para dos colores. En total, puede detectar hasta 11 parámetros de dispersión al mismo tiempo (9 detectores de fluorescencias, Forward scatter (FSC) y Side scatter (SSC)), así como purificar diferentes tipos de poblaciones celulares en base a características determinadas. La velocidad de adquisición puede llegar hasta 70000 eventos por segundo. Admite diferentes soportes tanto para la adquisición como para la separación de muestras. Está equipado con una unidad ACDU (Automated Cell Deposition Unit) para la separación en placas multipocillos o en portaobjetos. Dispone también de un sistema de refrigeración que permite la adquisición y separación de muestras con control de la temperatura. Utiliza el software FACSDiva para la adquisición y análisis de muestras.

Separador celular FACSAria Fusion

Fabricante: BD Bioscencies
Características técnicas: Dispone de cuatro líneas láser: El diodo Coherent® Sapphire™ de estado sólido azul (488 nm y >50 mW de potencia), permite detectar dos colores; láser rojo (640 nm y 100 mW JDS Uniphase™ HeNe refrigerado por aire) para dos colores, láser verde (561 nm y >50 mW) para cinco colores y el laser violeta en estado sólido (405 nm y 85 mW) para seis colores. En total, puede detectar hasta 18 parámetros de dispersión al mismo tiempo (16 detectores de fluorescencias, Forward scatter (FSC) y Side scatter (SSC)), así como purificar diferentes tipos de poblaciones celulares en base a características determinadas. La velocidad de adquisición puede llegar hasta 70000 eventos por segundo. Admite diferentes soportes tanto para la adquisición como para la separación de muestras. Está equipado con una unidad ACDU (Automated Cell Deposition Unit) para la separación en placas multipocillos o en portaobjetos. El equipo está integrado una cabina de Seguridad biológica tipo II y además, dispone de un sistema AMU de aspiración de aerosoles. La muestra puede estar refrigerada durante la adquisición y separación. Utiliza el software FACSDiva 8.0 para la adquisición y análisis de muestras.

Citómetro de Imagen ImageStream MarkII (Amnis, Luminex)

Fabricante: Amnis Luminex
Características técnicas: El citómetro de imagen ImageStream combina 4 laser (colineales 2 a 2), con 2 cámaras CCD que recogen el espectro de fluorescencia, además de un microscopio con los objetivos 20X, 40X y 60X. El volumen de adquisición es entre 20-200 µl con una eficiencia de un 95% de utilización de la muestra. La configuración óptica es la siguiente:

Iluminación
Excitación Laser (Power) Filtros
Cámara 2 405 nm (120 mW)

642 nm (150 mW)

468/76

532/56

628/64

690/60

760/80

Cámara 1 488 nm (200 mW)

561 nm (200 mW)

532/56

578/36

628/64

690/60

760/80

Side scatter 785 nm (70 mW) 760/80
Brightfield Multicanal 468/76 (Ch1)

578/36 (Ch6)

 

Objetivos

  40X 60X 20X

Apertura numérica

0.75 0.9 0.5

Tamaño pixel

0.5 x 0.5 µm 0.3 x 0.3 µm 1.0 x 1.0 µm
Campo de visión 60 x 128 µm 40 x 170 µm 120 x 256 µm
Imaging rate 2,000 cells/sec 1,200 cells/sec

4,000 cells/sec