Unidad de Citometría

El citómetro de imagen adquiere hasta 12 imágenes simultáneamente de cada célula/objeto. La señal es recogida en una cámara CCD que funciona en modo TDI (Time Delay Integration) generando una imagen combinada fruto de todas las anteriores. El citómetro de imagen ImageStream combina 4 laser (colineales 2 a 2), con 2 cámaras CCD que recogen el espectro de fluorescencia, además de un microscopio con los objetivos 20X, 40X y 60X. El volumen de adquisición es entre 20-200 µl con una eficiencia de un 95% de utilización de la muestra. La configuración óptica se puede ver en la Tabla 1 y 2.

Las muestras deben adquirirse en tubos de 1,5 ml y a una concentración de al menos un millón de células en 50 µl.

• ¿Qué células pueden analizarse?

Se pueden adquirir tanto células frescas como fijadas. El tamaño de la célula debe ser menor a 120µm para el aumento 20x, 60µm para 40x y 40µm para 60x. Este citómetro puede detectar objetos tan pequeños como macropartículas de 0,5 µm, bacterias y plaquetas utilizando los parámetros ópticos de superficie y SSCA (complejidad). Pequeños objetos con tamaños de 100 nm – 50um pueden ser detectados basándose en marcadores fluorescentes.

• ¿Cuánto tarda el análisis celular?

Dependiendo de la concentración de células y de la frecuencia de la población de interés, puede llevar desde unos minutos hasta unas horas registrar los datos del número de células de queramos adquirir. La velocidad de adquisición varía en función del objetivo utilizado, puede rondar entre 1.200-4.000 cells/sec. El análisis posterior de la muestra se realiza en el software IDEAS.

• ¿Es necesario reservar con antelación?

El equipo solo es utilizado por el personal especializado de la Unidad. Existe la posibilidad de reserva asistida e independiente (solo usuarios internos). El uso independiente está disponible en el horario de trabajo de los técnicos de la unidad, dependiendo de la disponibilidad de la reserva. Y se podrá hacer previo training por parte de la Unidad al usuario.

Canales: 135, rango de masas: 75–209 amu.

Sensibilidad: < 0.3% para 160Gd (M+1 para 159Tb),  < 0.3% para 174Hf (M+1 para 175Lu).

Respuesta del instrumento: 400K a 600 K counts/pg 159Tb.

Llímite de detección: 350 anticuerpos/célula

Pico de rendimiento: 500 (eventos/seg)

Flow rate: 30µl/min

El sistema es rápido y sencillo, muy parecido al realizado con fluorocromos. Las células en suspensión son también marcadas en tubos con un panel de anticuerpos frente a la proteína de interés. Existen más de 1000 anticuerpos conjugados para muestras humanas y de ratón que cubren una amplia gama de aplicaciones que incluyen fenotipado, monitorización de la respuesta inmune, expresión de citoquinas, respuestas de señalización, apoptosis, estructura y citoesqueleto, actividad enzimática y ciclo celular, inmuno-oncologçia, además de más de 20 kits prevalidados para diferentes aplicaciones en humano y ratón. Además, los kits de marcaje de anticuerpos permiten etiquetar la mayoría de los anticuerpos monoclonales (IgG) de su elección con más de 50 metales diferentes. Existen herramientas para diseño de paneles.

También se existe la posibilidad de utilizar un sistema de Barcoding que permite analizar un pool de hasta 20 muestras. Por lo tanto las muestras con los diferentes barcode se pueden combinar, posteriormente marcar y adquirir como una muestra multiplexada. Posteriormente el software realizara un debarcode y separara cada muestra individual.

Es muy importante utilizar buffers libres de metales. El último paso del protocolo incluye un intercalante del acido nucleíco utilizado para identificar eventos. Existen varios protocolos generales ya validados para el marcaje de los tres compartimentos celulares (superficie, citoplasma y núcleo). Las muestras pueden ser marcadas y enviadas para su posterior análisis.

https://pdv2.dvssciences.com/login

https://www.standardbio.com/support/instrument-support/cytof-helios-support#documents-anchor

https://iti.stanford.edu/himc/immune-monitoring-virtual-course-2020/part-2.html

• ¿Qué células pueden analizarse?

Se pueden adquirir tanto células frescas como fijadas, tanto humanas como de ratón. También se puede trabajar con nanopartículas o cualquier elemento que sea identificable mediante espectrometría de masas.  Las áreas de aplicación se muestran en la siguiente tabla.

• ¿Cuánto tarda el análisis celular?

Dependiendo de la concentración de células y de la frecuencia de la población de interés, puede llevar desde unos minutos hasta unas horas registrar los datos del número de células de queramos adquirir.

El sistema genera archivos con formato .fcs que pueden ser analizados en software para citometría convencionales y/o específicos para este tipo de sistemas complejos.

http://fluidigm.cytobank.org/

https://astrolabediagnostics.com/

https://www.flowjo.com/

http://www.omiq.ai/

https://iti.stanford.edu/himc/immune-monitoring-virtual-course-2020/part-3.html

• ¿Es necesario reservar con antelación?

El equipo solo es utilizado por el personal especializado de la Unidad.

Existen dos citómetros para uso en citometría convencional.

Las muestras deben colocarse en tubos de 5 ml compatibles con BD.

• ¿Qué células pueden analizarse?

Se pueden adquirir tanto células frescas como fijadas. Este citómetro puede detectar objetos tan pequeños como microparticulas de 0,5 µm, bacterias y plaquetas utilizando los parámetros ópticos de superficie y SSCA (complejidad). Pequeños objetos con tamaños de hasta 250 µm pueden ser detectados basándose en marcadores fluorescentes.

Las aplicaciones se centran en el área diferenciación celular, la inmunología y patología donde al trabajo con células primarias y líneas celulares, se le suma la detección de la expresión de genes reporteros marcados con proteínas fluorescentes, para monitorizar la eficiencia de transfecciones. Igualmente, se pueden realizar ensayos que nos dan información acerca de interacciones moleculares, la estructura de las proteínas y la secuencia del ADN. Estudio de nanopartículas y microvesículas.

• ¿Cuánto tarda el análisis celular?

Dependiendo de la concentración de células y de la frecuencia de la población de interés, puede llevar desde unos minutos hasta unas horas registrar los datos del número de células de queramos adquirir. La velocidad de adquisición varía en función del objetivo utilizado, puede rondar entre 10-100 µl/min con un ratio de adquisición de 10.000 eventoss/sec. El análisis posterior de la muestra se realiza en el software FACSDiva o software de análisis de citometría. Los software disponibles en la Unidad son FlowJo y OMIQ.

• ¿Es necesario reservar con antelación?

El equipo solo es utilizado por el personal especializado de la Unidad. Existe la posibilidad de reserva asistida e independiente (solo usuarios internos). El uso independiente está disponible en el horario de trabajo de los técnicos de la unidad, dependiendo de la disponibilidad de la reserva. Y se podrá hacer previo training por parte de la Unidad al usuario.

El sorter está integrado en una cabina de seguridad biológica clase II tipo A2, para proteger las muestras y el usuario de las contaminaciones. Tiene la posibilidad de sortear con Nozzel de 70, 85, 100 y 130-µm. Sistema de recogida con frio y calor de 2-4 muestras al mismo tiempo. Sistema de sorter de célula única en placas de 6, 24, 48, 96 y 384 pocillos.

Capaz de clasificar células a granel en Eppendorf de 1,5 ml, tubos FACS de 5 ml o tubos Falcon de 15 ml, así como de clasificar células individuales en placas o portaobjetos. Para la preparación de las muestras de usuarios internos, se aconseja mirar las recomendaciones del documento https://afrodita.genyo.es/resources/Centro/Citometr%c3%ada/preparacionMuestrasSorter.pdf

• ¿Qué células pueden analizarse?

Se pueden adquirir tanto células frescas como fijadas. Este citómetro puede detectar objetos tan pequeños como microparticulas de 0,5 µm, bacterias y plaquetas utilizando los parámetros ópticos de superficie y SSCA (complejidad). Pequeños objetos con tamaños de hasta 250 µm pueden ser detectados basándose en marcadores fluorescentes.

Las separaciones de células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés como los siguientes:

– Su posterior expansión y enriquecimiento en cultivo.

– Utilizarlas para ensayos funcionales.

– Usar las células separadas para su trasplante en animales o pacientes.

– Separar espermatozoides X de los Y para la selección del sexo.

– Separar levaduras, bacterias o fitoplancton.

– Selección y separación de orgánulos subcelulares.

– Aislar cromosomas específicos, siendo actualmente, la única técnica que permite el aislamiento en la práctica de gran número de cromosomas.

– Aislar un número suficiente de subpoblaciones celulares para su empleo en análisis genómico (microarrays).

• ¿Cuánto tarda el análisis celular?

La velocidad de clasificación celular depende de varios factores: La concentración inicial de la muestra, la frecuencia de células de interés a clasificar a partir de la muestra inicial, el tipo de célula que se clasifica, la calidad de las células proporcionadas en la muestra y la presión diferencial aplicada a las células. Esto significa que las velocidades de clasificación celular son variables y se determinan caso por caso.

Sin embargo, a modo de ejemplo: para pasar 1mL de PBMCs a una concentración de 10 millones de células/mL a la máxima presión diferencial (velocidad más alta) se tardará aproximadamente 30 minutos.

Se recomienda encarecidamente a los usuarios que filtren sus células antes de la clasificación y que suspendan sus muestras en una solución que contenga EDTA para evitar la aglutinación de células. Las aglomeraciones de células pueden obstruir los clasificadores celulares y prolongar el tiempo de clasificación. Para más consejos de preparación de muestra entrar en el siguiente documento:

https://afrodita.genyo.es/resources/Centro/Citometr%c3%ada/preparacionMuestrasSorter.pdf

• ¿Es necesario reservar con antelación?

El equipo solo es utilizado por el personal especializado de la Unidad

El lúminex 100 System permite el análisis de hasta 100 inmunoensayos, complejos genéticos y ensayos enzimáticos por pocillo. Admite varios formatos de ensayo, incluidos ensayos de ácidos nucleicos, ensayos de receptor-ligando, inmunoensayos y ensayos enzimáticos

El espectro de emisión de cada una de estas microesferas es único, lo que posibilita la identificación simultánea de todas ellas y por tanto, de la reacción o ensayo que se está llevando a cabo en la superficie de cada una de ellas y todos estos procedimientos dentro del mismo tubo de reacción. Las microesferas están marcadas con dos fluoróforos de forma que se establece un ratio de ambos en cada una de ellas. Así tendremos la primera de las microesferas con un 100% del primer fluoróforo y 0% del segundo, la 2ª microesfera con 99% del primer fluoróforo y un 1% del segundo, la 3ª con un 98% del primer fluoróforo y un 2% del segundo y así sucesivamente hasta completar 100 microesferas perfectamente identificables dentro del mismo tubo de reacción. Posteriormente, las microesferas son obligadas a pasar por una corriente de flujo. Cada una de ellas es clasificada de acuerdo al ratio de su marcaje fluorescente interno. Además de esto, el lúminex 100 System escanea cada una de las microesferas para determinar la presencia o ausencia de otro fluoróforo, el cual se habrá unido o no a los reactivos específicos de los ensayos (anticuerpos, oligonucleótidos, sustratos, etc.) anclados en la superficie de las esferas. Estas esferas son partículas de poliestireno que se han sometido a la acción del crosslinker durante su polimerización para conseguir una elevada estabilidad térmica y física. Para asegurar la estabilidad de estas microesferas es esencial protegerlas de la luz así como de elevadas temperaturas.

La adquisición se realiza en placa de 96 pocillos produciendo hasta 9.600 puntos de datos en unos 35 minutos. Es capaz de proporcionar resultados de bioensayos rápidos y rentables.

El sistema Bio-Plex 200 puede analizar diversos tipos de muestras, como suero, plasma, medio de cultivo, extractos, leche, saliva y otros.

Es importante preparar las muestras de forma consistente y utilizar los protocolos establecidos para el buen funcionamiento de los inmunoensayos, independientemente de la fuente de la muestra. Las muestras deben analizarse poco después de su recogida o congelarse en alícuotas para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación, que pueden degradar la muestra.

Las muestras de suero deben estar libres de lipemia, hemólisis, plaquetas y precipitados. Algunas muestras, como los homogeneizados tisulares, pueden requerir ultracentrifugación para su clarificación debido a los altos niveles de debris.

• ¿Qué células pueden analizarse?

Puede analizar diversos tipos de muestras, como suero, plasma, medio de cultivo, extractos, leche, saliva y otros. En la actualidad existe una gran variedad de kits disponibles. Kits para medición de: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM and IgE, Hepatitis B, SNP’s, carga viral de HIV, CV y HSV, tipaje DNA, Perfiles de transcripción, medición de citoquinas, mapeo de epitopos, marcadores cardiacos, Drogas de abuso, Test de alergia y autoinmunidad, hCG, AFP y ToRCH, etc.

• ¿Cuánto tarda el análisis celular?

Una placa de 96 pocillos y un rendimiento de hasta 9,600 datos en aproximadamente 35 minutos

• ¿Es necesario reservar con antelación?

El equipo solo es utilizado por el personal especializado de la Unidad, excepto para usuarios internos previo training por parte de la Unidad.

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: Dispone de un láser azul Coherent® Sapphire™ de estado sólido refrigerado por aire (488 nm y 20 mW de potencia), que permite detectar cuatro colores. Un laser rojo JDS Uniphase™ HeNe (633 nm y 17 mW), para dos colores. El número total de detectores es de 8 (6 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). El software para adquirir muestras y analizar es FACSDiva. El sistema posee un módulo de calidad que permite optimizar voltajes y realizar un control y seguimiento del funcionamiento del sistema.

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: BD FACSVerse™ es un citómetro de uso en investigación, dispone de tres líneas láser, 488 nm (azul) para 4 colores; 633 nm (rojo) para dos colores y violeta (407 nm) para dos colores. Puede detectar hasta 10 parámetros de dispersión (8 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). Presenta un sistema de laser que minimiza las pérdidas de luz y maximiza la resolución para aplicaciones multiparamétricas. Los láseres se caracterizan por presentar un micromotor para alineamiento automático. BD FACSVerse™, además de presentar las velocidades de adquisición estándar (alta, media y baja), presenta un modo de alta sensibilidad que hace más sencillo detectar partículas con marcaje débil. Su sistema fluídico permite adquirir muestras de forma manual en cualquier formato de tubo. Posee un cargador de muestras que permite analizar desde 30 a 40 tubos en una sola tanda, hasta placas de 96 y 384 pocillos. Dispone de medidor volumétrico. El software para adquirir muestras y analizar es FACSSuite. El sistema posee un módulo de calidad que optimiza voltajes y realiza un control y seguimiento del funcionamiento del equipo, lo que proporciona una gran reproducibilidad de los experimentos.

Fabricante: BD Bioscencies
Características técnicas: Dispone de tres líneas láser: El diodo Coherent® Sapphire™ de estado sólido azul (488 nm y 13 mW de potencia), permite detectar cinco colores; láser rojo (633 nm y 11 mW JDS Uniphase™ HeNe refrigerado por aire), para dos colores y el laser violeta en estado sólido (407 nm y 10 mW) para dos colores. En total, puede detectar hasta 11 parámetros de dispersión al mismo tiempo (9 detectores de fluorescencias, Forward scatter (FSC) y Side scatter (SSC)), así como purificar diferentes tipos de poblaciones celulares en base a características determinadas. La velocidad de adquisición puede llegar hasta 70000 eventos por segundo. Admite diferentes soportes tanto para la adquisición como para la separación de muestras. Está equipado con una unidad ACDU (Automated Cell Deposition Unit) para la separación en placas multipocillos o en portaobjetos. Dispone también de un sistema de refrigeración que permite la adquisición y separación de muestras con control de la temperatura. Utiliza el software FACSDiva para la adquisición y análisis de muestras.

Fabricante: BD Bioscencies
Características técnicas: Dispone de cuatro líneas láser: El diodo Coherent® Sapphire™ de estado sólido azul (488 nm y >50 mW de potencia), permite detectar dos colores; láser rojo (640 nm y 100 mW JDS Uniphase™ HeNe refrigerado por aire) para dos colores, láser verde (561 nm y >50 mW) para cinco colores y el laser violeta en estado sólido (405 nm y 85 mW) para seis colores. En total, puede detectar hasta 18 parámetros de dispersión al mismo tiempo (16 detectores de fluorescencias, Forward scatter (FSC) y Side scatter (SSC)), así como purificar diferentes tipos de poblaciones celulares en base a características determinadas. La velocidad de adquisición puede llegar hasta 70000 eventos por segundo. Admite diferentes soportes tanto para la adquisición como para la separación de muestras. Está equipado con una unidad ACDU (Automated Cell Deposition Unit) para la separación en placas multipocillos o en portaobjetos. El equipo está integrado una cabina de Seguridad biológica tipo II y además, dispone de un sistema AMU de aspiración de aerosoles. La muestra puede estar refrigerada durante la adquisición y separación. Utiliza el software FACSDiva 8.0 para la adquisición y análisis de muestras.