Unidad de Citometría de flujo y masas

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Unidad de Citometría de flujo y masas

Presentación de la Unidad de Citometría de flujo y masas

La Unidad de Citometría de flujo y masas de Genyo se dedica a la aplicación y el desarrollo de diferentes técnicas enfocadas a detección de las características de las partículas biológicas a través de la citometría de flujo, masas y la separación celular, con el fin de facilitar los máximos avances en la investigación biomédica.

La citometría es la tecnología que permite medir propiedades físicas y químicas de células vivas u otras partículas biológicas. En este área nos encontramos con la citometría de flujo y su nueva variante, la citometría de masas.

El fundamento de la CITOMETRÍA DE FLUJO se basa en hacer pasar una suspensión de partículas alineadas y delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estas señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales, que son procesadas por un equipo informático.

La citometría tiene su base junto con los primeros avances en microscopía. Se comenzó investigando la incidencia de la luz (UV) sobre las muestras, pero no fue hasta 1934 cuando se desarrolló la primera técnica de conteo de células en un capilar, en 1880s se empezó a utilizar fluorocromos y en los años 1960-70s se incorporaron a la citometría para medir el contenido de ADN de las células y realizar inmunofenotipaje. Con el tiempo, se empezó a pensar en la separación celular asociada a la citometría. En Estados Unidos (Los Alamos National Laboratories), se desarrolló el primer contador celular capaz de medir las células y cargarlas en gotas y separarlas. Los separadores celulares tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo, pero con la capacidad adicional de separar y recuperar partículas selectivamente de la suspensión líquida en función de sus características.

La citometría de flujo ha sido y es fundamental en la ciencia, los beneficios que se ha obtenido y que se siguen obteniendo con esta tecnología son innumerables, pero tiene su limitaciones, principalmente cuando queremos medir más de 10 parámetros tenemos el gran problema de la superposición de los espectros de emisión, y el ruido de fondo.

Estas limitaciones llevaron a la búsqueda de nuevas soluciones capaces de medir de forma simultánea en una única célula multitud de parámetros. De esta forma apareció la CITOMETRÍA DE MASAS, donde se combinan dos grandes tecnologías bien establecidas como son la citometría de flujo  y la espectrometría de masas.

Este método ofrece la posibilidad de analizar de forma simultánea más de 35 parámetros sin problemas de superposición entre espectros y disminuyendo el ruido de fondo. El Dr. Sean C. Bendall y sus colaboradores fueron los pioneros, ellos en vez de usar moléculas fluorescentes usaron isotipos estables de elementos químicos pesados (metales de transición y lantánidos) para marcar los anticuerpos. Hay un total de aproximadamente 50 elementos disponibles.

Como la principal diferencia entre cada uno de estos elementos es su masa atómica, los podemos discriminar en base a su peso. El único equipo que puede hacer este trabajo es el espectrómetro de masas con un analizador de tiempo de vuelo (TOF-MS).

El fundamento de la técnica es el siguiente  las células son marcadas en suspensión con un panel diseñado de metales pesados conjugados con anticuerpos frente a dianas en la superficie y en el interior de las células, la técnica es muy similar a la citometría de flujo convencional. La alta pureza de los isotopos metálicos asegura un nivel muy bajo de background por solapamiento entre señales o por componentes celulares endógenos. En el interior de Helios las células son atomizadas individualmente para quedarnos solo con los iones metálicos. Los iones procedentes de cada célula marcada forman nubes aisladas de iones. Los metales iónicos son medidos en la cámara Time-Of-Flight (TOF) y en función de su carga y masa (m/z) tendrán diferentes tiempos de vuelo antes de llegar al detector, los cuales serán únicos y específicos. Finalmente, el detector produce un espectro de masas donde identifica y representa la cantidad de cada isotipo metálico marcado por célula. Los datos se obtienen en formato .fcs y se pueden analizar en software de análisis convencionales o específicos para muestras multiparamétricas. 

Misión

La Unidad de Citometría de flujo y masas tiene como labor principal proporcionar apoyo técnico en el área de la citometría, tanto a los grupos de investigación del centro, como a entidades externas.

Gracias al equipamiento tecnológico de última generación que posee la unidad, y a la gran experiencia del personal responsable científico y técnico, es posible desarrollar las aplicaciones requeridas por los usuarios. De esta forma podemos alcanzar una de las prioridades de GENYO, como es la integración de la investigación básica, aplicada y traslacional, minimizando la transición entre el desarrollo de nuevas tecnologías, productos y procedimientos, y su aplicación en el ámbito sanitario. Igualmente, el equipamiento de la unidad pretende facilitar la generación de nuevos sistemas de diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades asociadas a la variabilidad genética humana mediante la aplicación de las nuevas tecnologías, con el fin de lograr una investigación de excelencia en el área de oncología y genómica aplicada a la salud.

La Unidad de Citometría de flujo y masas centra su actividad en el análisis mediante citometría de flujo, masas y separación celular. De esta forma podemos detectar la presencia de moléculas de interés mediante técnicas de inmunofluorescencia, sensores fluorescentes, fusión a proteínas fluorescentes y espectrometría de masas, tanto en partículas fijadas como en células vivas, lo que posibilita abordar entre otros, el estudio de procesos dinámicos celulares. Asimismo, en la unidad se lleva a cabo la actividad de separación celular mediante sorter, que facilita el aislamiento de poblaciones específicas para su posterior cultivo, estudio genómico o proteómico.

Análisis mediante citometría de masas

CyTOF®2 mejorado a Helios (DVS Sciences, Fluidigm), es un sistema de CyTOF® (Cytometry by Time of Flight), que incluye los más recientes avances en citometría de masas y está diseñado para ser una herramienta innovadora en la detección y análisis bionalítico a nivel de célula individual. El sistema se basa en la tecnología de espectrometría de masas en TOF con plasma acoplado inductivamente (ICP-TOF-MS), este nos permite analizar muestras unidas a isotopos de metales pesados, evitando el problema de la superposición de espectros y background que tenemos en la citometría de flujo convencional. Actualmente hay disponibles más de 40 marcadores para poder combinar. Como resultado obtenemos una gran resolución en los 135 canales de detección de los que dispone el sistema, permitiendo resolver de forma simultánea múltiples pruebas a velocidades altas, maximizando la información obtenida por célula en una única muestra.

La aplicación de esta tecnología hace que entendamos el organismo como un sistema de gran heterogeneidad celular, por ello la citometría de masas nos permite analizar marcadores tanto en el interior como en el exterior de la célula, dándonos una visión de su amplitud y complejidad, permitiendo una compresión a nivel de sistema y funcionalidad, con la resolución de célula única.

Las áreas de aplicación de esta innovadora tecnología incluyen desde cáncer, inmunología, inmunofenotipaje, enfermedades genéticas, screening de biomarcadores, metodología del desarrollo, detección en microbiología y patógenos (viral), oncología, farmacogenética y Stem Cell.

El sistema de trabajo con Helios es el siguiente:

DISEÑO: El método para el diseño de tu experimento es muy similar al de citometría de flujo convencional. Además, existe un programa que facilita la creación de los paneles https://www.fluidigm.com/paneldsigner.

CONSTRUCCIÓN: Existen en el mercado más de 400 anticuerpos conjugados con metales pesados para diferentes aplicaciones, tanto para humanos como para ratón. Además, kits que te permiten unir el anticuerpo de interés al metal pesado. También se existe la posibilidad de utilizar un sistema de Barcoding que permite analizar varias muestras juntas.

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-metal.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-panel-kits.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-maxpar.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-multi-metal-kits.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-cell-id.php

http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/cytof-antibodies.aspx

http://www.biolegend.com/maxpar_ready

http://www.ebioscience.com/application/flow-cytometry/cytof.htm

https://www.fluidigm.com/singlearticles/how-barcoding-works

MARCAJE: El sistema es rápido sencillo, muy parecido al realizado con fluorocromos. Las células en suspensión son también marcadas en tubos con un panel de anticuerpos frente a la proteína de interés. Es muy importante utilizar buffers libres de metales. El último paso del protocolo incluye un intercalante del acido nucleíco utilizado para identificar eventos. Existen varios protocolos generales ya validados para el marcaje de los tres compartimentos celulares (superficie, citoplasma y núcleo)  https://www.fluidigm.com/productsupport/cytof-helios. Las muestras pueden ser marcadas y enviadas para su posterior análisis.

ADQUISICIÓN: La adquisición en Helios se realiza mediante un sistema de adquisición automático. Esta nueva versión del equipo, comparado con otras versiones, ahorra tiempo y facilita la introducción de la muestra. Además el software es intuitivo, con calibración automática, que permite mantener la calidad durante la adquisición.

ANÁLISIS: El sistema genera archivos con formato .fcs que pueden ser analizados en software para citometría convencionales y/o específicos para este tipo de sistemas complejos. (http://fluidigm.cytobank.org/).

Análisis mediante citometría de flujo

La citometría de flujo utiliza como fuente de excitación el láser que incide sobre una partícula biológica que pasa  por un punto de interrogación, esto permite obtener de forma rápida y cuantitativa la medida de forma simultánea de múltiples parámetros de cada partícula biológica individual. El sistema puede informarnos de la complejidad y tamaño de la partícula, además si la partícula ha sido marcada con fluorocromos, podemos obtener información adicional. Además, la sensibilidad de los equipos de última generación permite la detección de poblaciones extremadamente raras.

En el centro Genyo, las aplicaciones más tradicionales de la citometría se centran en el área de la diferenciación celular, la inmunología y patología donde al trabajo con células primarias y líneas celulares, se le suma la detección de la expresión de genes reporteros tales como GFP, permitiendo monitorizar tanto las transfecciones como la eficiencia en los niveles de expresión de proteínas. Igualmente, se pueden realizar ensayos que nos dan información acerca de interacciones moleculares, la estructura de las proteínas y la secuencia del ADN. Esta técnica permite detectar la unión de proteínas a una molécula diana in vitro, conocer la modulación de una señal de traducción intracelular o identificar proteínas con unión, actividad enzimática especificas y sus niveles de expresión.

Aunque las líneas de investigación de Genyo se centran en áreas de aplicación clínica o la investigación básica en rama biomédica, también se puede hacer uso de la citometría en áreas tan diversas como medio ambiente, donde se utiliza para el estudio de organismos unicelulares, toxicidad in situ, o análisis genómico en células procedentes de organismos superiores o inferiores.

Separación mediante sorter

La separación celular por citometría de flujo o “Cell Sorting” es el proceso de separación física de partículas en base a la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica. Hay que destacar el gran potencial del análisis multiparamétrico para la identificación de poblaciones sumamente específicas. Las separaciones de células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés, y requieren de la utilización de sofisticados aparatos de citometría de flujo, denominados “Cell Sorter”. El sorter se caracterizan porque pueden conseguir un gran porcentaje de partículas seleccionadas recogidas en el colector, del total de partículas activadas por el sorter, junto con una gran pureza, es decir, porcentaje de partículas sorteadas recogidas que cumplen los criterios seleccionados, en función del total analizado.

Las células que exhiben alguna actividad especial pueden ser recogidas en un tubo, en placas o portaobjetos de microscopio, con una pureza cercana al 99%. Dichas partículas conservan sus características, incluida la viabilidad celular, para ser utilizadas en estudios posteriores.

La separación o aislamiento de partículas puede ser de gran valor para aislar poblaciones celulares específicas en condiciones asépticas para:

    • Su posterior expansión y enriquecimiento en cultivo.
    • Utilizarlas para ensayos funcionales.
    • Usar las células separadas para su trasplante en animales o pacientes.
    • Separar espermatozoides X de los Y para la selección del sexo.
    • Separar levaduras, bacterias o fitoplancton.
    • Selección y separación de orgánulos subcelulares.
    • Aislar cromosomas específicos, siendo actualmente, la única técnica que permite el aislamiento en la práctica de gran número de cromosomas.
    • Aislar un número suficiente de subpoblaciones celulares para su empleo en análisis genómico (microarrays).
    • Aislar células únicas para su clonación en pocillos individuales de una placa o para análisis por PCR.

Para apoyar a la comunidad científica y desarrollar el tipo de estudios expuesto anteriormente, la Unidad de Citometría cuenta con el siguiente equipamiento:

Citómetro de masas CyTOF®2 upgrade to Helios

Fabricante: DVS Sciences (Fluidigm)
Características técnicas:
El sistema se basa en la tecnología de espectrometría de masas de Time-Of-Flight con plasma acoplado inductivamente (ICP-TOF-MS), este nos permite analizar muestras unidas a isotopos de metales pesados. Presenta un sistema de introducción automática de las muestras que aumenta la eficiencia en un 60% con respecto a versiones anteriores y podemos recolectar más datos en menos tiempo y con menos muestra. Además, permite adquirir hasta 5 ml de muestra lo que permite trabajar más fácilmente con barcoding, permitiendo adquirir todo el experimento sin necesidad de ir introduciendo muestras secuencialmente. El sistema de agitación elimina el problema de sedimentación. Se elimina el uso de jeringas para introducir la muestra y de solución transportadora, que hace diluir la muestra, es su caso se utiliza el argón. Tiene un nuevo inyector de muestra transformado que hace que la nube de iones procedentes de cada células sea la mitad de grande (aprox. 1mm) que las de CyTOF 1 y 2. Además, un amplificador de señal modificado que conserva el rango dinámico necesario por la señal necesitando menos señales por pulso, en definitiva, menos pulsos para detectar la señal, por lo que detecta más señales con menos ruido de fondo. Debido a estos dos cambios se dobla el número de células que pueden resolverse por unidad de tiempo. Helios escribe cuatro nuevos parámetros Gaussianos para discriminación en las fcs files: anchura, residual, centro y offset. Estos parámetros están pensados para diferenciar eventos de iones fusionados de los simples.

En general las características principales son:

    • Canales: 121 a 135
    • Rango de masas: 75–209 amu
    • Sensibilidad: 0.3% para 159Tb
    • Respuesta del instrumento: 400K a 600 K counts/pg 159Tb
    • Límite de detección: 350 anticuerpos/célula
    • Calibración: automática
    • Pico de rendimiento: 2.000 (eventos/seg)

Citómetro de flujo BD FACSCanto II™

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: Dispone de un láser azul Coherent® Sapphire™ de estado sólido refrigerado por aire (488 nm y 20 mW de potencia), que permite detectar cuatro colores. Un laser rojo JDS Uniphase™ HeNe (633 nm y 17 mW), para dos colores. El número total de detectores es de 8 (6 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). El software para adquirir muestras y analizar es FACSDiva. El sistema posee un módulo de calidad que permite optimizar voltajes y realizar un control y seguimiento del funcionamiento del sistema.

Citómetro de flujo BD FACSVerse™

Fabricante: BD Biosciences
Características técnicas: BD FACSVerse™ es un citómetro de uso en investigación, dispone de tres líneas láser, 488 nm (azul) para 4 colores; 633 nm (rojo) para dos colores y violeta (407 nm) para dos colores. Puede detectar hasta 10 parámetros de dispersión (8 detectores de fluorescencias y dos de parámetros morfológicos). Presenta un sistema de laser que minimiza las pérdidas de luz y maximiza la resolución para aplicaciones multiparamétricas. Los láseres se caracterizan por presentar un micromotor para alineamiento automático. BD FACSVerse™, además de presentar las velocidades de adquisición estándar (alta, media y baja), presenta un modo de alta sensibilidad que hace más sencillo detectar partículas con marcaje débil. Su sistema fluídico permite adquirir muestras de forma manual en cualquier formato de tubo. Posee un cargador de muestras que permite analizar desde 30 a 40 tubos en una sola tanda, hasta placas de 96 y 384 pocillos. Dispone de medidor volumétrico. El software para adquirir muestras y analizar es FACSSuite. El sistema posee un módulo de calidad que optimiza voltajes y realiza un control y seguimiento del funcionamiento del equipo, lo que proporciona una gran reproducibilidad de los experimentos.

Separador celular BD FACSAria™

Fabricante: BD Bioscencies
Características técnicas: Dispone de tres líneas láser: El diodo Coherent® Sapphire™ de estado sólido azul (488 nm y 13 mW de potencia), permite detectar cinco colores; láser rojo (633 nm y 11 mW JDS Uniphase™ HeNe refrigerado por aire), para dos colores y el laser violeta en estado sólido (407 nm y 10 mW) para dos colores. En total, puede detectar hasta 11 parámetros de dispersión al mismo tiempo (9 detectores de fluorescencias, Forward scatter (FSC) y Side scatter (SSC)), así como purificar diferentes tipos de poblaciones celulares en base a características determinadas. La velocidad de adquisición puede llegar hasta 70000 eventos por segundo. Admite diferentes soportes tanto para la adquisición como para la separación de muestras. Está equipado con una unidad ACDU (Automated Cell Deposition Unit) para la separación en placas multipocillos o en portaobjetos. Dispone también de un sistema de refrigeración que permite la adquisición y separación de muestras con control de la temperatura. Utiliza el software FACSDiva para la adquisición y análisis de muestras.

Listado de servicios

01Asesoramiento a los usuarios del servicio de citometría de flujo.
    • Iniciación y entrenamiento de los distintos usuarios que hacen uso por primera vez de los citómetros analizado.
    • Supervisión de las operaciones diarias en los citómetros de flujo analizadores.
    • Asistencia a los usuarios en los problemas con los equipos.
    • Asistencia sobre metodología y diseño experimental.
02Aplicaciones.
    • Análisis multiparamétrico complejo: Mediante la combinación de fluorocromos compatibles con las líneas de láser y filtros o utilización de metales pesados, es posible realizar un inmunofenotipaje. El inmunofenotipaje se refiere a la utilización de herramientas inmunológicas, como anticuerpos acoplados a marcadores para la detección específica de antígenos localizados tanto en el interior como en la superficie de la célula. Permite identificar, enumerar y caracterizar cualquier célula individual o subcomponente celular. Con aplicaciones tan importantes como la identificación de enfermedades hematológicas, desordenes hematológicos, trasplantes, diagnóstico de enfermedades infecciosas, detección de la hemorragia fetomaterna, test de alergia basados en la en la activación de basófilos, activación plaquetaria, diagnóstico y monitorización de enfermedades autoinmunes, identificación y cuantificación de autoanticuerpos, identificación de fenotipos multiresistentes a las drogas en cáncer, cuantificación proteínas solubles, etc.
    • Detección de genes reporteros: Una de las técnicas más importantes para el estudio de expresión de un gen de interés es la fusión de genes reporteros o informadores, que permiten una determinación rápida y fácil de la actividad de un promotor. En citometría se utiliza mucho GFP como gen reportero.
    • Estudio de procesos de muerte celular: Puede diferenciarse si la célula está en una fase temprana o tardía de la apoptosis, o si por el contrario la muerte ha ocurrido por necrosis. Para ello se cuantifica la cantidad de Annexina-V unida a la fofatidilserina de la superficie de las células apoptóticas, o la internalización de Ioduro de Propidio (IP) o 7-aminoactinomycin (7-AAD), debido a la formación de poros en la membrana celular, típicos de las células necróticas.
    • Ciclo Celular y proliferación celular: En los estudios del ciclo celular pueden diferenciarse las distintas fases de división de una célula, en función de la cantidad de ADN, lo que nos permite calcular índices o ratios entre picos. Las fases que se diferencian en citometría son G0/G1, que corresponde a fase quiescente y de preparación para división con una cantidad de ADN 2n. Fase S, es la parte del ciclo con síntesis de ADN, por lo tanto el marcaje aumenta. Y la fase G2/M, donde aumenta la proporción de ADN el doble (4n). Los marcajes utilizados suelen ser IP, AmCyan, 7-AAD y BrdU, para citometría de flujo y IdU, pRB (Ser807/811), Cyclin B1, Ki67; pHistone H3 (Ser28), para citometría de masas.
    • Ensayos funcionales. Mediante citometría pueden cuantificarse aquellas propiedades dinámicas de las células que pueden modificarse rápidamente gracias a sensores fluorescentes, cuyas propiedades ópticas o de distribución cambian en respuesta al fenómeno de interés. Algunos ejemplos son detección de ROS, o la medida ratiométrica de Fluo/Indo para estudiar el flujo de calcio.
03Separación celular.
    • Las separaciones de células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés.
    • Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Bendall & Simons et al.. Science 332, 687 (2011).