La Unidad de Citometría de flujo y masas centra su actividad en el análisis mediante citometría de flujo, masas y separación celular. De esta forma podemos detectar la presencia de moléculas de interés mediante técnicas de inmunofluorescencia, sensores fluorescentes, fusión a proteínas fluorescentes y espectrometría de masas, tanto en partículas fijadas como en células vivas, lo que posibilita abordar entre otros, el estudio de procesos dinámicos celulares. Asimismo, en la unidad se lleva a cabo la actividad de separación celular mediante sorter, que facilita el aislamiento de poblaciones específicas para su posterior cultivo, estudio genómico o proteómico.

Análisis mediante citometría de masas

CyTOF®2 mejorado a Helios (DVS Sciences, Fluidigm), es un sistema de CyTOF® (Cytometry by Time of Flight), que incluye los más recientes avances en citometría de masas y está diseñado para ser una herramienta innovadora en la detección y análisis bionalítico a nivel de célula individual. El sistema se basa en la tecnología de espectrometría de masas en TOF con plasma acoplado inductivamente (ICP-TOF-MS), este nos permite analizar muestras unidas a isotopos de metales pesados, evitando el problema de la superposición de espectros y background que tenemos en la citometría de flujo convencional. Actualmente hay disponibles más de 40 marcadores para poder combinar. Como resultado obtenemos una gran resolución en los 135 canales de detección de los que dispone el sistema, permitiendo resolver de forma simultánea múltiples pruebas a velocidades altas, maximizando la información obtenida por célula en una única muestra.

 

 

La aplicación de esta tecnología hace que entendamos el organismo como un sistema de gran heterogeneidad celular, por ello la citometría de masas nos permite analizar marcadores tanto en el interior como en el exterior de la célula, dándonos una visión de su amplitud y complejidad, permitiendo una compresión a nivel de sistema y funcionalidad, con la resolución de célula única.

Las áreas de aplicación de esta innovadora tecnología incluyen desde cáncer, inmunología, inmunofenotipaje, enfermedades genéticas, screening de biomarcadores, metodología del desarrollo, detección en microbiología y patógenos (viral), oncología, farmacogenética y Stem Cell.

 

      

 

El sistema de trabajo con Helios es el siguiente:

 

-     DISEÑO: El método para el diseño de tu experimento es muy similar al de citometría de flujo convencional. Además, existe un programa que facilita la creación de los paneles https://www.fluidigm.com/paneldsigner.

 

-    CONSTRUCCIÓN: Existen en el mercado más de 400 anticuerpos conjugados con metales pesados para diferentes aplicaciones, tanto para humanos como para ratón. Además, kits que te permiten unir el anticuerpo de interés al metal pesado. También se existe la posibilidad de utilizar un sistema de Barcoding que permite analizar varias muestras juntas.

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-metal.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-panel-kits.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-maxpar.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-multi-metal-kits.php

http://maxpar.fluidigm.com/product-catalog-cell-id.php

http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/cytof-antibodies.aspx

http://www.biolegend.com/maxpar_ready

http://www.ebioscience.com/application/flow-cytometry/cytof.htm

https://www.fluidigm.com/singlearticles/how-barcoding-works

 

-    MARCAJE: El sistema es rápido sencillo, muy parecido al realizado con fluorocromos. Las células en suspensión son también marcadas en tubos con un panel de anticuerpos frente a la proteína de interés. Es muy importante utilizar buffers libres de metales. El último paso del protocolo incluye un intercalante del acido nucleíco utilizado para identificar eventos. Existen varios protocolos generales ya validados para el marcaje de los tres compartimentos celulares (superficie, citoplasma y núcleo)  https://www.fluidigm.com/productsupport/cytof-helios. Las muestras pueden ser marcadas y enviadas para su posterior análisis.


 

-      ADQUISICIÓN: La adquisición en Helios se realiza mediante un sistema de adquisición automático. Esta nueva versión del equipo, comparado con otras versiones, ahorra tiempo y facilita la introducción de la muestra. Además el software es intuitivo, con calibración automática, que permite mantener la calidad durante la adquisición.

 

 

-      ANÁLISIS: El sistema genera archivos con formato .fcs que pueden ser analizados en software para citometría convencionales y/o específicos para este tipo de sistemas complejos. (http://fluidigm.cytobank.org/).



Análisis mediante citometría de flujo 

La citometría de flujo utiliza como fuente de excitación el láser que incide sobre una partícula biológica que pasa  por un punto de interrogación, esto permite obtener de forma rápida y cuantitativa la medida de forma simultánea de múltiples parámetros de cada partícula biológica individual. El sistema puede informarnos de la complejidad y tamaño de la partícula, además si la partícula ha sido marcada con fluorocromos, podemos obtener información adicional. Además, la sensibilidad de los equipos de última generación permite la detección de poblaciones extremadamente raras.

 

En el centro Genyo, las aplicaciones más tradicionales de la citometría se centran en el área de la diferenciación celular, la inmunología y patología donde al trabajo con células primarias y líneas celulares, se le suma la detección de la expresión de genes reporteros tales como GFP, permitiendo monitorizar tanto las transfecciones como la eficiencia en los niveles de expresión de proteínas. Igualmente, se pueden realizar ensayos que nos dan información acerca de interacciones moleculares, la estructura de las proteínas y la secuencia del ADN. Esta técnica permite detectar la unión de proteínas a una molécula diana in vitro, conocer la modulación de una señal de traducción intracelular o identificar proteínas con unión, actividad enzimática especificas y sus niveles de expresión.

 

Aunque las líneas de investigación de Genyo se centran en áreas de aplicación clínica o la investigación básica en rama biomédica, también se puede hacer uso de la citometría en áreas tan diversas como medio ambiente, donde se utiliza para el estudio de organismos unicelulares, toxicidad in situ, o análisis genómico en células procedentes de organismos superiores o inferiores.

 

 

 

Separación mediante sorter

La separación celular por citometría de flujo o “Cell Sorting” es el proceso de separación física de partículas en base a la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica. Hay que destacar el gran potencial del análisis multiparamétrico para la identificación de poblaciones sumamente específicas. Las separaciones de células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés, y requieren de la utilización de sofisticados aparatos de citometría de flujo, denominados “Cell Sorter”. El sorter se caracterizan porque pueden conseguir un gran porcentaje de partículas seleccionadas recogidas en el colector, del total de partículas activadas por el sorter, junto con una gran pureza, es decir, porcentaje de partículas sorteadas recogidas que cumplen los criterios seleccionados, en función del total analizado.

 

Las células que exhiben alguna actividad especial pueden ser recogidas en un tubo, en placas o portaobjetos de microscopio, con una pureza cercana al 99%. Dichas partículas conservan sus características, incluida la viabilidad celular, para ser utilizadas en estudios posteriores.

 

La separación o aislamiento de partículas puede ser de gran valor para aislar poblaciones celulares específicas en condiciones asépticas para:

- Su posterior expansión y enriquecimiento en cultivo.

- Utilizarlas para ensayos funcionales.

- Usar las células separadas para su trasplante en animales o pacientes.

- Separar espermatozoides X de los Y para la selección del sexo.

- Separar levaduras, bacterias o fitoplancton.

- Selección y separación de orgánulos subcelulares.

- Aislar cromosomas específicos, siendo actualmente, la única técnica que permite el aislamiento en la práctica de gran número de cromosomas.

- Aislar un número suficiente de subpoblaciones celulares para su empleo en análisis genómico (microarrays).

- Aislar células únicas para su clonación en pocillos individuales de una placa o para análisis por PCR.